Pemisahan oleh Pengendapan
3.1 Pengamatan Umum
Pada era awal, kimia protein satu-satunya cara praktis untuk memisahkan jenis protein yang berbeda yang disebabkan bagian dari campuran untuk endapan melalui perubahan dari beberapa properti dari pelarut. Endapan dapat disaring dan dipekatkan dalam pelarut asli. Prosedur-prosedur ini tetap menjadi metode sangat penting dari pemurnian protein, kecuali penyaringan yang sebagian besar telah digantikan oleh sentrifugasi. Presipitat protein adalah agregat molekul protein yang cukup besar sehingga menghasilkan hasil yang rendah untuk disentrifugasi. Dalam beberapa kasus, agregasi dilanjutkan dengan presipitasi flocculates, tetapi biasanya gerakan dan tabrakan partikel dalam suspensi tetap berukuran kecil. Hal ini mengakibatkan penyumbatan kertas filter dan sentrifugasi yang baik memerlukan lebih dari 1 g contoh. Berbagai metode mendapatkan endapan yang dijelaskan dalam bagian terpisah di bawah ini.
Klasifikasi protein diklasifikasikan berdasarkan kelarutannya dan meskipun klasifikasi ini sebagian besar telah dilupakan hari ini, kata-kata yang masih digunakan sehari-hari ketika berbicara albumin serum atau imunoglobulin. Globulin didefinisikan sebagai protein tidak larut dalam larutan garam rendah, serum globulin dapat diendapkan dengan hanya mengencerkan serum dengan air, di mana albumin tersisa di larutan. Perilaku globulin adalah contoh presipitasi isoelektrik dalam penggaraman-dalam jangkauan. Klasifikasi ini membingungkan karena beberapa protein yang tidak larut pada pH 6, tetapi larut dalam garam yang rendah pada pH 8. Namun demikian, ada protein yang benar sesuai dengan deskripsi globulin. Protein-protein jenis ini adalah protein pada umumnya dengan kelarutan rendah dalam media air yang cenderung memiliki kandungan asam amino hidrofobik substansial di permukaannya. Sebaliknya, ada banyak albumin dengan kelarutan tinggi terhadap air dan sifat hidrofobik rendah.
Distribusi residu hidrofilik dan hidrofobik pada permukaan molekul protein adalah fitur yang menentukan kelarutan dalam berbagai pelarut. Meskipun kelompok hidrofobik cenderung terkonsentrasi di sekitar bagian dalam molekul protein, jumlah besar berada di permukaan, kontak dengan pelarut. Kelompok hidrofobik pada permukaan molekul protein adalah penting dalam menentukan perilaku dari molekul sebagaimana dengan kelompok polar lainnya. Pelarut selalu berbasis air, meskipun ada alasan untuk menduga akan mungkin untuk mengisolasi protein membran yang tidak terpisahkan dengan menggunakan pelarut nonair. Sifat-sifat pelarut air dapat dimanipulasi untuk mengubah kelarutan protein oleh perubahan kekuatan ion, pH, penambahan pelarut organik larut, zat terlarut inert lainnya atau polimer, atau kombinasinya bersama-sama dengan variasi suhu. Prosedur yang paling banyak digunakan adalah penggunaan garam netral menyebabkan presipitasi selektif. Ini adalah subyek dari dua bagian selanjutnya.
3.2 Kelarutan Protein pada Konsentrasi Garam Rendah
Sebagian besar enzim yang ada di cairan sel sebagai protein larut, sering dalam sup terkonsentrasi yang mungkin sebanyak 40 % protein. Sehingga mereka sangat larut dalam kondisi garam fisiologis, suatu kekuatan ion umumnya sekitar 0,15 - 0,2 M, dan pH netral. Setelah diekstrak, kondisi ini dapat dengan mudah bervariasi, meskipun gampang untuk meningkatkan konsentrasi protein (dengan menghilangkan pelarut), atau untuk mengurangi kekuatan ionik substansial (dengan menghilangkan ion dengan berat molekul rendah). Kelarutan adalah hasil interaksi dengan kutub, interaksi pelarut ion berair dengan garam ini, dan untuk beberapa hal , elektrostatik antara agregat molekul. Agregat kecil menetralkan daya tarik yang kuat.
Dalam rentang kekuatan ion dari nol sampai fisiologis, beberapa bentuk protein presipitat karena kekuatan tidak mencukupi. Misalnya, permukaan hidrofobik yang tinggi berarti interaksi rendah dengan kelompok dibebankan pelarut dan lebih sedikit untuk berinteraksi dengan garam. Biaya keseluruhan mendekati nol meminimalkan tolakan elektrostatik, dan mungkin, dekat dengan titik isoelektrik, mengakibatkan daya tarik elektrostatik molekul satu sama lain. Hal ini disebut presipitasi isoelektrik protein globulin yang menunjukkan kelarutan minimum sekitar titik isoelektrik, yang mungkin cukup rendah untuk menghasilkan presipitasi. Dalam campuran protein yang sangat rumit oleh protein kopresipitasi berbeda dengan agregat dengan sifat yang sama untuk membentuk presipitasi isoelektrik. Dalam banyak kasus, presipitasi isoelektrik dapat dibentuk dalam jaringan ekstrak dengan menurunkan pH menjadi antara 6,0 dan 5,0. Ini bukan sekedar agregasi protein larut, yang termasuk agregat untuk partikulat bahan seperti ribosom dan fragmen membran, seperti yang dijabarkan sebelumnya.
Kelarutan protein jenis globulin menurun dengan berkurangnya konsentrasi garam. Ini jarang dapat dimanfaatkan dengan ekstrak kasar sejak penurunan dua kali lipat dalam garam hanya dapat dicapai dengan mudah dengan menambahkan dalam volume yang sama dari air, jika kelarutan tidak menurun oleh lebih dari dua kali lipat, tidak ada yang diperoleh. Namun, itu bisa menjadi properti yang berguna (meskipun kadang-kadang ada ketidaknyamanan) pada tahap berikutnya ketika penghilangan garam dicoba oleh dialisis atau dengan filtrasi gel. Pada dialisis terhadap buffer kekuatan rendah ion, presipitasi dapat terbentuk di dalam kantung dialisis. Jika endapan meliputi sebagian besar, enzim.
Diperlukan, atau sebagai alternatif tidak sama sekali, sebuah hasil pemurnian. Endapan disentrifugasi. Namun, dalam kolom filtrasi gel, pengembangan endapan isoelektrik bisa menjadi gangguan. Agregat dapat menyumbat kolom, atau diendapkan dan terjebak, mereka tetap di belakang hingga garam dihapus dari campuran protein asli menangkap dan pelarutan kembali endapan. Penghilangan garam dri gel filtrasi hanya mungkin tidak bekerja di bawah kondisi ini.
Presipitasi isoelektrik protein berkelarutan rendah dapat ditingkatkan dengan masuknya zat terlarut yang berkelarutan lebih tinggi. Jadi pelarut organik atau polietilen glikol bersama-sama dengan penyesuaian pH dapat menghasilkan endapan yang diinginkan. Salah satu contoh dari metode dalam pemurnian ragi fosfofruktokinase.
Peningkatan kelarutan (pada pH tertentu dan suhu tertentu) dengan peningkatan konsentrasi garam dikenal sebagai "salting in". Kebalikan dari proses ini, dengan pengenceran atau dialisis, adalah lebih mungkin berguna dalam pemurnian enzim. Sebuah penggaraman khas dalam kurva untuk protein murni, sedangkan stepness dari respon terhadap garam mungkin cukup untuk mendorong pengendapan dengan pengenceran.
Point Catatan Praktek
Presipitat isoelektrik kebanyakan agregat protein yang berbeda dan mungkin termasuk partikulat fragmen dan kompleks protein asam nukleat. Jika komposisi awal larutan berubah, sebuah enzim yang diinginkan mungkin tidak memperlihatkan perilaku kelarutan yang sama. Endapan isoelektrik biasanya terjadi dengan menurunkan pH di bawah pH fisiologis, pastikan enzim stabil pada pH yang dibutuhkan. Menjaga suhu rendah akan meningkatkan kemungkinan stabilitas dan penurunan kelarutan. Namun, jika menyesuaikan pH di 0 oC, jangan lupa untuk standarisasi pH meter pada suhu ini, dengan menggunakan buffer standar es dingin.
Singkatnya, penggaraman dalam rentang dapat dimanfaatkan dalam pemurnian dalam dua cara yang berbeda. Pertama, agregasi dapat terjadi dengan pengenceran atau dialisis, dan jika enzim yang diperlukan hadir dalam pemurnian agregat berguna akan telah dicapai. Kedua, curah isoelektrik dapat digunakan, mengeksploitasi variasi kelarutan dengan pH, tanpa mengubah kekuatan ion. Dalam situasi baik, adalah enzim yang diperlukan tetap dalam larutan, dengan tingkat pemurnian dicapai biasanya minimal sejak proporsi yang relatif kecil dari total protein yang mungkin dalam endapan. Dalam hal ini, apa yang terjadi hanya membersihkan ekstrak.
3.3 Penggaraman Out dengan Konsentrasi Garam Tinggi
Aspek Umum Kelarutan Protein pada Konsentrasi Garam Tinggi
Bagian ini menjelaskan salah satu teknik yang paling banyak digunakan dalam pemurnian enzim, yaitu penggaraman dari protein, dengan kadar garam yang tinggi. Hal ini sangat berbeda dari penggaraman yang berlaku. Meskipun ada kecenderungan untuk tipe protein globulin (mereka yang memiliki kelarutan rendah pada kekuatan ion yang rendah dekat titik isoelektrik mereka) juga untuk menunjukkan kelarutan relatif rendah dalam larutan garam tinggi, ada banyak pengecualian. Jadi serum γ-globulin, protein khas tidak larut pada garam rendah, juga pengendapan dengan amonium sulfat pada konsentrasi yang relatif rendah sekitar 1,5 M. Di sisi lain, beberapa globulin serum lain (α-dan β-) memiliki cukup amonium rata-rata kelarutan sulfat, pengendapan sekitar 2,5 - 3 M. out Penggaraman sebagian besar tergantung pada sifat hidrofobik protein, sedangkan pengasinan di lebih tergantung pada distribusi muatan permukaan dan interaksi polar dengan pelarut.
Sebuah molekul protein yang khas dalam larutan memiliki patch hidrofobik (sisi rantai Phe, Tyr, trp, Leu, Ile, Met, Val). Memaksa ini ke dalam kontak dengan pelarut air menyebabkan sebuah pemesanan molekul air, secara efektif membekukan mereka di sekitar rantai samping. Memesan ini adalah situasi termodinamika tidak stabil karena merupakan penurunan besar dalam entropi dibandingkan dengan protein unsolvated ditambah molekul air gratis.
Jika proses melarutkan protein kering dalam air diwakili oleh mana nH2O mewakili air memerintahkan sekitar residu hidrofobik (kami akan mengabaikan hidrogen terikat dan air terikat kutub dalam deskripsi ini), maka ΔSo besar dan negatif karena tingkat keteraturan diperkenalkan. Proses ini diketahui terjadi, sehingga ΔGo akan cenderung negatif. Akibatnya ΔHo juga sangat negatif (ΔHo = ΔGo + TΔSo). Pertimbangkan dua molekul protein yang datang bersama-sama dan berinteraksi melalui residu hidrofobik, melepaskan air: Jelas ΔSo akan besar dan positif dalam hal ini, perubahan entalpi diharapkan menjadi kira-kira kebalikan dari proses., dan begitu juga akan positif. Sekarang ΔGo mungkin kecil, dan tandanya akan tergantung pada besaran relatif ΔHo dan ΔSo. Dalam konsentrasi garam rendah, protein larut air yang khas. ΔGo akan positif. Karena protein larut, agregasi tidak terjadi untuk setiap tingkat yang signifikan. Namun, jika molekul air dibebaskan terjebak, reaksi dapat dilakukan untuk agregasi kemajuan dan protein akan terjadi. Garam menjadi ion terhidrasi; sehingga menambah jumlah besar perangkap air garam.
Setelah air yang cukup telah menarik diri dari protein, agregasi terjadi. Perhatikan bahwa ΔHo positif untuk reaksi ini. Akibatnya, persamaan Arhenius memprediksi bahwa agregasi terjadi akibat kenaikan kekuatan hidrofobik dengan suhu. Ini adalah fitur yang diakui interaksi hidrofobik. Garam curah dalam banyak kasus memiliki ΔHo positif, karena bentuk endapan lebih pada tingkat garam diberikan pada suhu yang lebih tinggi.
Cara lain untuk menggambarkan agregasi patch hidrofobik pada protein permukaan karena konsentrasi garam tinggi adalah untuk mengatakan bahwa, sebagai ion garam terlarut, ada kecenderungan yang lebih besar, ketika tersedia secara bebas molekul air menjadi searce, untuk menarik dari memerintahkan beku molekul air dari rantai samping hidrofobik, sehingga mengekspos daerah lemak telanjang yang ingin berinteraksi dengan satu sama lain. Protein dengan jumlah yang lebih besar, atau kelompok yang lebih besar untuk residu seperti pada permukaannya, akan menjadi agregat cepat, sedangkan protein dengan sedikit residu permukaan nonpolar dapat tetap berada dalam larutan bahkan pada konsentrasi garam tertinggi. Sifat garam adalah sangat penting di sini; garam-garam yang benar-benar mengikat dan berinteraksi langsung dengan protein memiliki efek destabilisasi. Garam optimum adalah mereka yang mendorong hidrasi daerah kutub (dan dehidrasi daerah hidrofobik) pada protein tanpa interaksi langsung sendiri. kation monovalen dan anion divalen ini tertentu lebih suka kation divalen seperti magnesium, dan anion monovalen seperti klorida yang memiliki kecenderungan yang lebih besar untuk mengikat protein. Interpretasi alternatif dari efek garam pada kelarutan protein yang lebih kompleks melibatkan pertimbangan istilah energi bebas. Efektivitas garam yang berbeda juga telah berkorelasi dengan selisih tegangan permukaan molar karena garam yang terlarut dalam pelarut.
Strating dengan campuran kasar, co-agregasi sangat luas; molekul identik individu tidak akan mencari satu sama lain ketika molekul lain lengket hadiah itu sendiri bersama. Namun demikian, banyak enzim diendapkan dari larutan rentang cukup sempit konsentrasi garam untuk membuat prosedur metode yang sangat efektif fraksinasi. Beberapa hasil pada efek kehadiran protein lain pada kelarutan beberapa enzim.
Sampel tidak murni tidak mengikuti aturan ini, karena kopresipitasi terjadi ke nilai tersebut tergantung pada sifat-sifat ini protein lainnya. Secara umum, kelarutan komponen tertentu menurun dengan adanya protein lain.
Meskipun keluar pengasinan sangat bergantung pada interaksi hidrofobik, fitur lain lakukan mempengaruhi kelarutan. Jadi pH dapat mengubah kelarutan, sebuah penghapusan charge membuat permukaan yang kurang polar. Kelarutan dalam garam biasanya tertinggi sekitar pH 7, dimana protein memiliki kelompok yang paling dikenakan. Di sisi lain, agregasi mungkin terjadi lebih mudah dekat dengan titik isoelektrik protein. Salah satu contoh klasik dari hal ini adalah dalam pemurnian langkah salah satu glyceraldehydes fosfat dehidrogenase (EC 1.2.1.12) dari otot kelinci. Pada pH 6, enzim ini larut dalam amonium sulfat 3,2 M, tetapi jika pH disesuaikan dengan 7,5 atau lebih tinggi, itu presipitat, dan bahkan mungkin mengkristal, dari ekstrak kasar. Titik isoelektriknya (setidaknya pada konsentrasi garam rendah) adalah sekitar 8,5.
Suhu mempengaruhi kelarutan protein pada konsentrasi garam tinggi dengan cara yang tidak biasa karena pengaruh suhu terhadap hidrofobik interaksi seperti dijelaskan di atas. Dalam rentang salting out, kelarutan protein umumnya menurun dengan meningkatnya suhu. Banyak waktu kelarutan protein keruh, disiapkan untuk kristalisasi pada suhu kamar, menjadi benar-benar jelas ketika ditempatkan di 40 oC. Praktis Pertimbangan dalam fraksinasi salting out.
Salting dari protein melibatkan pelarutan garam ke dalam larutan yang mengandung protein. Beberapa fitur dari proses ini harus dipertimbangkan. Sifat garam adalah semua penting. Seseorang harus mempertimbangkan karakteristik fisik seperti kelarutan garam, selain adalah efektivitas dalam menyebabkan presipitasi. Garam yang paling efektif adalah mereka dengan dibebankan beberapa anion seperti sulfat, fosfat, dan sitrat, kation ini relatif kurang penting. Pengasinan keluar kemampuan anion mengikuti seri Hofmeister, yang untuk beberapa anion umum adalah SCN-, CLO4-, NO3-, Br-, Cl-, asetat-, SO42-, PO43-, dll meskipun fosfat akan muncul dari ini menjadi lebih efektif daripada sulfat. Dalam praktik, fosfat pada pH neutural terdiri dari campuran HPO42- dan ion H2PO4-, yang kurang efektif dibandingkan PO43-. Sementara kation, ion monovalen harus digunakan, dengan NH4+> K+> Na+ dalam efektivitas curah hujan. Dari garam murah umum yang efektif dalam menyebabkan curah adalah natrium, kalium, amonium sulfat, fosfat, dan sitrat.
Setelah memutuskan untuk melakukan fraksinasi amonium sulfat, keputusan berikutnya adalah persentase saturasi untuk mencoba. Bahan pengendapan sebelum 25 % jenuh umumnya partikulat dan preaggregatedor protein berat molekul yang sangat tinggi. Distribusi curah hujan khas protein dari ekstrak kasar. Sebuah set ideal dari hasil uji coba dengan fraksionasi amonium sulfat. Fraksionasi selalu merupakan kompromi antara pemulihan aktivitas dan tingkat pemurnian. Jika bahan sumber yang berharga atau sulit diperoleh, atau tujuannya adalah untuk mendapatkan enzim sebanyak mungkin tanpa memperhatikan terlalu banyak untuk kemurnian mutlak, maka tingkat pemurnian mungkin akan dikorbankan untuk pemulihan. Di sisi lain, jika fraksionasi adalah langkah pertama dari bahan sumber tersedia, pemulihan bisa dikorbankan untuk kemurnian. Dalam banyak kasus yang lebih canggih proses (kromatografi pertukaran ion kromatografi afinitas adsorpsi) dapat mengikuti fraksionasi amonium sulfat dan perilaku enzim yang diinginkan mungkin sama terlepas dari jumlah pengotor. Dalam kasus yang memotong luas amonium sulfat dapat digunakan, sehingga pemurnian relatif sedikit, langkah yang pada dasarnya membersihkan.
Solusi untuk garam yang akan ditambahkan harus diberikan dengan sistem pengadukan, dan amonium sulfat padat ditimbang keluar. Setiap benjolan harus dipecah sebelum perlahan menambahkan padatan. Bit pertama bisa dilarutkan dalam cukup cepat, tetapi sebagai persen kejenuhan yang dimaksud adalah kenaikan terakhir mendekati garam harus ditambahkan lebih lambat. Udara terlarut yang keluar dari solusi dan menyebabkan buih, namun tidak ada salahnya dilakukan kecuali overvigorous aduk itu sendiri menyebabkan buih, dalam hal pengaruh tegangan permukaan pada protein yang tertangkap dalam gelembung dapat menyebabkan denaturasi. Setelah bit terakhir garam telah dilarutkan, aduk harus terus selama 10 - 30 menit untuk memungkinkan equilibrium lengkap antara protein terlarut dan agregasi, dibandingkan dengan solusi yang disentrifus. Umumnya sekitar 105 g / menit sudah cukup, yaitu 10.000x g selama 10 menit atau 3.000x g selama 30 menit, meskipun pada konsentrasi garam yang lebih tinggi agak lebih sentrifugasi mungkin diperlukan. Supernatan dialirkan, volume mencatat, dan jumlah garam yang dibutuhkan untuk pemotongan berikutnya dihitung. Endapan dilarutkan dalam buffer yang cocok. Perhatikan bahwa volume buffer perlu tidak lebih dari 1 - 2 kali volume endapan, karena itu akan cukup untuk mengurangi konsentrasi garam di bawah titik pengendapan protein ini. Jika semua endapan tidak larut, bahan larut mungkin didenaturasi / partikulat, dan harus dihilangkan dengan sentrifugasi. Itu selalu yang terbaik untuk menjaga solusi sebagai terkonsentrasi di protein mungkin. Hal ini meningkatkan stabilitas, dan selalu casier untuk mencairkan sesuatu yang lebih dari itu adalah untuk reconcentrate itu.
Endapan dipekatkan mengandung sejumlah besar sulfat amonium, dan biasanya ini harus dihapus sebelum melanjutkan ke langkah berikutnya. Dialisis atau filtrasi gel pada kolom "desalting" adalah metode biasa yang digunakan. Pengukuran aktivitas enzim dapat dilakukan pada endapan dipekatkan atau pada supernatan, tapi berhati-hatilah dalam kasus yang terakhir jumlah amonium sulfat ditambahkan ke dalam campuran dengan sampel bisa mengganggu tes tersebut; endapan selalu harus diuji pula, untuk meskipun kerugian dalam fraksinasi amonium sulfat biasanya kecil, aktivitas sembuh dalam endapan mungkin tidak sebanyak perbedaan antara supernatant berturut-turut.
Daripada melarutkan garam yang solid ke dalam sampel, dimungkinkan untuk menambah volume yang cocok larutan jenuh, bukan dalam cara yang sama seperti menambahkan pelarut organik. Hal ini sangat berguna jika enzim ini semua dipicu oleh kejenuhan 50%, karena hal ini hanya akan melibatkan meningkat dua kali lipat volume. Pada skala besar ini akan diterima, tetapi dalam skala kecil dapat menjadi metode yang tepat. Persen lebih tinggi masih lebih membutuhkan peningkatan dalam volume, dan dilusi dari protein mengarah ke kebutuhan kejenuhan persen masih lebih tinggi untuk presipitasi setara, sehingga metode ini tidak disarankan untuk pergi jauh di atas 50%.
Hal penting untuk diingat adalah bahwa garam pernah presipitat semua enzim, tetapi hanya mengurangi kelarutan nya. Jika campuran mulai mengandung enzim Anda, katakanlah, 1 mg mL-1, kemudian pengurangan dalam kelarutan untuk 0,1 mg mL-1 menyebabkan 90% dari itu untuk mengendapkan. Ini akan menjadi pemulihan diterima. Di sisi lain, jika enzim Anda hanya pada 0,1 mg mL-1 untuk memulai dengan, konsentrasi garam yang sama tidak akan menyebabkan pengendapan apapun. Dengan kata lain, konsentrasi garam jangkauan untuk curah bukanlah milik absolut dari enzim yang bersangkutan, namun tergantung pada sifat-sifat protein lain yang hadir (kopresipitasi) dan pada konsentrasi protein dalam larutan awal. Konsentrasi garam yang berbeda mungkin diperlukan pada tahapan yang berbeda dalam prosedur pemurnian.
Akhirnya, aplikasi penting dari prosedur penggaraman AOU tidak begitu banyak untuk sampel fraksionasi, tetapi untuk konsentrasinya. Sebuah cluate dari kolom pertukaran ion atau dari filtrasi gel mungkin perlu berkonsentrasi. Penggaraman keluar dengan menambahkan amonium sulfat yang cukup untuk mengendapkan semua protein adalah cara yang efisien untuk melakukan hal ini asalkan sampel tidak terlalu encer untuk mulai dengan. Hal ini mudah untuk larut dalam amonium sulfat 60 g untuk setiap 100 mL, untuk memberikan sekitar 85% jenuh larutan. Beberapa protein memiliki kelarutan lebih dari 0,1 mg mL-1 pada tingkat amonium sulfat. Tetapi jika konsentrasi protein mulai kurang dari 1 mg mL-1. Salah satu harus mencoba untuk meningkatkan ini dengan, misalnya, ultrafiltrasi sebelum salting out.
Pada era awal, kimia protein satu-satunya cara praktis untuk memisahkan jenis protein yang berbeda yang disebabkan bagian dari campuran untuk endapan melalui perubahan dari beberapa properti dari pelarut. Endapan dapat disaring dan dipekatkan dalam pelarut asli. Prosedur-prosedur ini tetap menjadi metode sangat penting dari pemurnian protein, kecuali penyaringan yang sebagian besar telah digantikan oleh sentrifugasi. Presipitat protein adalah agregat molekul protein yang cukup besar sehingga menghasilkan hasil yang rendah untuk disentrifugasi. Dalam beberapa kasus, agregasi dilanjutkan dengan presipitasi flocculates, tetapi biasanya gerakan dan tabrakan partikel dalam suspensi tetap berukuran kecil. Hal ini mengakibatkan penyumbatan kertas filter dan sentrifugasi yang baik memerlukan lebih dari 1 g contoh. Berbagai metode mendapatkan endapan yang dijelaskan dalam bagian terpisah di bawah ini.
Klasifikasi protein diklasifikasikan berdasarkan kelarutannya dan meskipun klasifikasi ini sebagian besar telah dilupakan hari ini, kata-kata yang masih digunakan sehari-hari ketika berbicara albumin serum atau imunoglobulin. Globulin didefinisikan sebagai protein tidak larut dalam larutan garam rendah, serum globulin dapat diendapkan dengan hanya mengencerkan serum dengan air, di mana albumin tersisa di larutan. Perilaku globulin adalah contoh presipitasi isoelektrik dalam penggaraman-dalam jangkauan. Klasifikasi ini membingungkan karena beberapa protein yang tidak larut pada pH 6, tetapi larut dalam garam yang rendah pada pH 8. Namun demikian, ada protein yang benar sesuai dengan deskripsi globulin. Protein-protein jenis ini adalah protein pada umumnya dengan kelarutan rendah dalam media air yang cenderung memiliki kandungan asam amino hidrofobik substansial di permukaannya. Sebaliknya, ada banyak albumin dengan kelarutan tinggi terhadap air dan sifat hidrofobik rendah.
Distribusi residu hidrofilik dan hidrofobik pada permukaan molekul protein adalah fitur yang menentukan kelarutan dalam berbagai pelarut. Meskipun kelompok hidrofobik cenderung terkonsentrasi di sekitar bagian dalam molekul protein, jumlah besar berada di permukaan, kontak dengan pelarut. Kelompok hidrofobik pada permukaan molekul protein adalah penting dalam menentukan perilaku dari molekul sebagaimana dengan kelompok polar lainnya. Pelarut selalu berbasis air, meskipun ada alasan untuk menduga akan mungkin untuk mengisolasi protein membran yang tidak terpisahkan dengan menggunakan pelarut nonair. Sifat-sifat pelarut air dapat dimanipulasi untuk mengubah kelarutan protein oleh perubahan kekuatan ion, pH, penambahan pelarut organik larut, zat terlarut inert lainnya atau polimer, atau kombinasinya bersama-sama dengan variasi suhu. Prosedur yang paling banyak digunakan adalah penggunaan garam netral menyebabkan presipitasi selektif. Ini adalah subyek dari dua bagian selanjutnya.
3.2 Kelarutan Protein pada Konsentrasi Garam Rendah
Sebagian besar enzim yang ada di cairan sel sebagai protein larut, sering dalam sup terkonsentrasi yang mungkin sebanyak 40 % protein. Sehingga mereka sangat larut dalam kondisi garam fisiologis, suatu kekuatan ion umumnya sekitar 0,15 - 0,2 M, dan pH netral. Setelah diekstrak, kondisi ini dapat dengan mudah bervariasi, meskipun gampang untuk meningkatkan konsentrasi protein (dengan menghilangkan pelarut), atau untuk mengurangi kekuatan ionik substansial (dengan menghilangkan ion dengan berat molekul rendah). Kelarutan adalah hasil interaksi dengan kutub, interaksi pelarut ion berair dengan garam ini, dan untuk beberapa hal , elektrostatik antara agregat molekul. Agregat kecil menetralkan daya tarik yang kuat.
Dalam rentang kekuatan ion dari nol sampai fisiologis, beberapa bentuk protein presipitat karena kekuatan tidak mencukupi. Misalnya, permukaan hidrofobik yang tinggi berarti interaksi rendah dengan kelompok dibebankan pelarut dan lebih sedikit untuk berinteraksi dengan garam. Biaya keseluruhan mendekati nol meminimalkan tolakan elektrostatik, dan mungkin, dekat dengan titik isoelektrik, mengakibatkan daya tarik elektrostatik molekul satu sama lain. Hal ini disebut presipitasi isoelektrik protein globulin yang menunjukkan kelarutan minimum sekitar titik isoelektrik, yang mungkin cukup rendah untuk menghasilkan presipitasi. Dalam campuran protein yang sangat rumit oleh protein kopresipitasi berbeda dengan agregat dengan sifat yang sama untuk membentuk presipitasi isoelektrik. Dalam banyak kasus, presipitasi isoelektrik dapat dibentuk dalam jaringan ekstrak dengan menurunkan pH menjadi antara 6,0 dan 5,0. Ini bukan sekedar agregasi protein larut, yang termasuk agregat untuk partikulat bahan seperti ribosom dan fragmen membran, seperti yang dijabarkan sebelumnya.
Kelarutan protein jenis globulin menurun dengan berkurangnya konsentrasi garam. Ini jarang dapat dimanfaatkan dengan ekstrak kasar sejak penurunan dua kali lipat dalam garam hanya dapat dicapai dengan mudah dengan menambahkan dalam volume yang sama dari air, jika kelarutan tidak menurun oleh lebih dari dua kali lipat, tidak ada yang diperoleh. Namun, itu bisa menjadi properti yang berguna (meskipun kadang-kadang ada ketidaknyamanan) pada tahap berikutnya ketika penghilangan garam dicoba oleh dialisis atau dengan filtrasi gel. Pada dialisis terhadap buffer kekuatan rendah ion, presipitasi dapat terbentuk di dalam kantung dialisis. Jika endapan meliputi sebagian besar, enzim.
Diperlukan, atau sebagai alternatif tidak sama sekali, sebuah hasil pemurnian. Endapan disentrifugasi. Namun, dalam kolom filtrasi gel, pengembangan endapan isoelektrik bisa menjadi gangguan. Agregat dapat menyumbat kolom, atau diendapkan dan terjebak, mereka tetap di belakang hingga garam dihapus dari campuran protein asli menangkap dan pelarutan kembali endapan. Penghilangan garam dri gel filtrasi hanya mungkin tidak bekerja di bawah kondisi ini.
Presipitasi isoelektrik protein berkelarutan rendah dapat ditingkatkan dengan masuknya zat terlarut yang berkelarutan lebih tinggi. Jadi pelarut organik atau polietilen glikol bersama-sama dengan penyesuaian pH dapat menghasilkan endapan yang diinginkan. Salah satu contoh dari metode dalam pemurnian ragi fosfofruktokinase.
Peningkatan kelarutan (pada pH tertentu dan suhu tertentu) dengan peningkatan konsentrasi garam dikenal sebagai "salting in". Kebalikan dari proses ini, dengan pengenceran atau dialisis, adalah lebih mungkin berguna dalam pemurnian enzim. Sebuah penggaraman khas dalam kurva untuk protein murni, sedangkan stepness dari respon terhadap garam mungkin cukup untuk mendorong pengendapan dengan pengenceran.
Point Catatan Praktek
Presipitat isoelektrik kebanyakan agregat protein yang berbeda dan mungkin termasuk partikulat fragmen dan kompleks protein asam nukleat. Jika komposisi awal larutan berubah, sebuah enzim yang diinginkan mungkin tidak memperlihatkan perilaku kelarutan yang sama. Endapan isoelektrik biasanya terjadi dengan menurunkan pH di bawah pH fisiologis, pastikan enzim stabil pada pH yang dibutuhkan. Menjaga suhu rendah akan meningkatkan kemungkinan stabilitas dan penurunan kelarutan. Namun, jika menyesuaikan pH di 0 oC, jangan lupa untuk standarisasi pH meter pada suhu ini, dengan menggunakan buffer standar es dingin.
Singkatnya, penggaraman dalam rentang dapat dimanfaatkan dalam pemurnian dalam dua cara yang berbeda. Pertama, agregasi dapat terjadi dengan pengenceran atau dialisis, dan jika enzim yang diperlukan hadir dalam pemurnian agregat berguna akan telah dicapai. Kedua, curah isoelektrik dapat digunakan, mengeksploitasi variasi kelarutan dengan pH, tanpa mengubah kekuatan ion. Dalam situasi baik, adalah enzim yang diperlukan tetap dalam larutan, dengan tingkat pemurnian dicapai biasanya minimal sejak proporsi yang relatif kecil dari total protein yang mungkin dalam endapan. Dalam hal ini, apa yang terjadi hanya membersihkan ekstrak.
3.3 Penggaraman Out dengan Konsentrasi Garam Tinggi
Aspek Umum Kelarutan Protein pada Konsentrasi Garam Tinggi
Bagian ini menjelaskan salah satu teknik yang paling banyak digunakan dalam pemurnian enzim, yaitu penggaraman dari protein, dengan kadar garam yang tinggi. Hal ini sangat berbeda dari penggaraman yang berlaku. Meskipun ada kecenderungan untuk tipe protein globulin (mereka yang memiliki kelarutan rendah pada kekuatan ion yang rendah dekat titik isoelektrik mereka) juga untuk menunjukkan kelarutan relatif rendah dalam larutan garam tinggi, ada banyak pengecualian. Jadi serum γ-globulin, protein khas tidak larut pada garam rendah, juga pengendapan dengan amonium sulfat pada konsentrasi yang relatif rendah sekitar 1,5 M. Di sisi lain, beberapa globulin serum lain (α-dan β-) memiliki cukup amonium rata-rata kelarutan sulfat, pengendapan sekitar 2,5 - 3 M. out Penggaraman sebagian besar tergantung pada sifat hidrofobik protein, sedangkan pengasinan di lebih tergantung pada distribusi muatan permukaan dan interaksi polar dengan pelarut.
Sebuah molekul protein yang khas dalam larutan memiliki patch hidrofobik (sisi rantai Phe, Tyr, trp, Leu, Ile, Met, Val). Memaksa ini ke dalam kontak dengan pelarut air menyebabkan sebuah pemesanan molekul air, secara efektif membekukan mereka di sekitar rantai samping. Memesan ini adalah situasi termodinamika tidak stabil karena merupakan penurunan besar dalam entropi dibandingkan dengan protein unsolvated ditambah molekul air gratis.
Jika proses melarutkan protein kering dalam air diwakili oleh mana nH2O mewakili air memerintahkan sekitar residu hidrofobik (kami akan mengabaikan hidrogen terikat dan air terikat kutub dalam deskripsi ini), maka ΔSo besar dan negatif karena tingkat keteraturan diperkenalkan. Proses ini diketahui terjadi, sehingga ΔGo akan cenderung negatif. Akibatnya ΔHo juga sangat negatif (ΔHo = ΔGo + TΔSo). Pertimbangkan dua molekul protein yang datang bersama-sama dan berinteraksi melalui residu hidrofobik, melepaskan air: Jelas ΔSo akan besar dan positif dalam hal ini, perubahan entalpi diharapkan menjadi kira-kira kebalikan dari proses., dan begitu juga akan positif. Sekarang ΔGo mungkin kecil, dan tandanya akan tergantung pada besaran relatif ΔHo dan ΔSo. Dalam konsentrasi garam rendah, protein larut air yang khas. ΔGo akan positif. Karena protein larut, agregasi tidak terjadi untuk setiap tingkat yang signifikan. Namun, jika molekul air dibebaskan terjebak, reaksi dapat dilakukan untuk agregasi kemajuan dan protein akan terjadi. Garam menjadi ion terhidrasi; sehingga menambah jumlah besar perangkap air garam.
Setelah air yang cukup telah menarik diri dari protein, agregasi terjadi. Perhatikan bahwa ΔHo positif untuk reaksi ini. Akibatnya, persamaan Arhenius memprediksi bahwa agregasi terjadi akibat kenaikan kekuatan hidrofobik dengan suhu. Ini adalah fitur yang diakui interaksi hidrofobik. Garam curah dalam banyak kasus memiliki ΔHo positif, karena bentuk endapan lebih pada tingkat garam diberikan pada suhu yang lebih tinggi.
Cara lain untuk menggambarkan agregasi patch hidrofobik pada protein permukaan karena konsentrasi garam tinggi adalah untuk mengatakan bahwa, sebagai ion garam terlarut, ada kecenderungan yang lebih besar, ketika tersedia secara bebas molekul air menjadi searce, untuk menarik dari memerintahkan beku molekul air dari rantai samping hidrofobik, sehingga mengekspos daerah lemak telanjang yang ingin berinteraksi dengan satu sama lain. Protein dengan jumlah yang lebih besar, atau kelompok yang lebih besar untuk residu seperti pada permukaannya, akan menjadi agregat cepat, sedangkan protein dengan sedikit residu permukaan nonpolar dapat tetap berada dalam larutan bahkan pada konsentrasi garam tertinggi. Sifat garam adalah sangat penting di sini; garam-garam yang benar-benar mengikat dan berinteraksi langsung dengan protein memiliki efek destabilisasi. Garam optimum adalah mereka yang mendorong hidrasi daerah kutub (dan dehidrasi daerah hidrofobik) pada protein tanpa interaksi langsung sendiri. kation monovalen dan anion divalen ini tertentu lebih suka kation divalen seperti magnesium, dan anion monovalen seperti klorida yang memiliki kecenderungan yang lebih besar untuk mengikat protein. Interpretasi alternatif dari efek garam pada kelarutan protein yang lebih kompleks melibatkan pertimbangan istilah energi bebas. Efektivitas garam yang berbeda juga telah berkorelasi dengan selisih tegangan permukaan molar karena garam yang terlarut dalam pelarut.
Strating dengan campuran kasar, co-agregasi sangat luas; molekul identik individu tidak akan mencari satu sama lain ketika molekul lain lengket hadiah itu sendiri bersama. Namun demikian, banyak enzim diendapkan dari larutan rentang cukup sempit konsentrasi garam untuk membuat prosedur metode yang sangat efektif fraksinasi. Beberapa hasil pada efek kehadiran protein lain pada kelarutan beberapa enzim.
Sampel tidak murni tidak mengikuti aturan ini, karena kopresipitasi terjadi ke nilai tersebut tergantung pada sifat-sifat ini protein lainnya. Secara umum, kelarutan komponen tertentu menurun dengan adanya protein lain.
Meskipun keluar pengasinan sangat bergantung pada interaksi hidrofobik, fitur lain lakukan mempengaruhi kelarutan. Jadi pH dapat mengubah kelarutan, sebuah penghapusan charge membuat permukaan yang kurang polar. Kelarutan dalam garam biasanya tertinggi sekitar pH 7, dimana protein memiliki kelompok yang paling dikenakan. Di sisi lain, agregasi mungkin terjadi lebih mudah dekat dengan titik isoelektrik protein. Salah satu contoh klasik dari hal ini adalah dalam pemurnian langkah salah satu glyceraldehydes fosfat dehidrogenase (EC 1.2.1.12) dari otot kelinci. Pada pH 6, enzim ini larut dalam amonium sulfat 3,2 M, tetapi jika pH disesuaikan dengan 7,5 atau lebih tinggi, itu presipitat, dan bahkan mungkin mengkristal, dari ekstrak kasar. Titik isoelektriknya (setidaknya pada konsentrasi garam rendah) adalah sekitar 8,5.
Suhu mempengaruhi kelarutan protein pada konsentrasi garam tinggi dengan cara yang tidak biasa karena pengaruh suhu terhadap hidrofobik interaksi seperti dijelaskan di atas. Dalam rentang salting out, kelarutan protein umumnya menurun dengan meningkatnya suhu. Banyak waktu kelarutan protein keruh, disiapkan untuk kristalisasi pada suhu kamar, menjadi benar-benar jelas ketika ditempatkan di 40 oC. Praktis Pertimbangan dalam fraksinasi salting out.
Salting dari protein melibatkan pelarutan garam ke dalam larutan yang mengandung protein. Beberapa fitur dari proses ini harus dipertimbangkan. Sifat garam adalah semua penting. Seseorang harus mempertimbangkan karakteristik fisik seperti kelarutan garam, selain adalah efektivitas dalam menyebabkan presipitasi. Garam yang paling efektif adalah mereka dengan dibebankan beberapa anion seperti sulfat, fosfat, dan sitrat, kation ini relatif kurang penting. Pengasinan keluar kemampuan anion mengikuti seri Hofmeister, yang untuk beberapa anion umum adalah SCN-, CLO4-, NO3-, Br-, Cl-, asetat-, SO42-, PO43-, dll meskipun fosfat akan muncul dari ini menjadi lebih efektif daripada sulfat. Dalam praktik, fosfat pada pH neutural terdiri dari campuran HPO42- dan ion H2PO4-, yang kurang efektif dibandingkan PO43-. Sementara kation, ion monovalen harus digunakan, dengan NH4+> K+> Na+ dalam efektivitas curah hujan. Dari garam murah umum yang efektif dalam menyebabkan curah adalah natrium, kalium, amonium sulfat, fosfat, dan sitrat.
Setelah memutuskan untuk melakukan fraksinasi amonium sulfat, keputusan berikutnya adalah persentase saturasi untuk mencoba. Bahan pengendapan sebelum 25 % jenuh umumnya partikulat dan preaggregatedor protein berat molekul yang sangat tinggi. Distribusi curah hujan khas protein dari ekstrak kasar. Sebuah set ideal dari hasil uji coba dengan fraksionasi amonium sulfat. Fraksionasi selalu merupakan kompromi antara pemulihan aktivitas dan tingkat pemurnian. Jika bahan sumber yang berharga atau sulit diperoleh, atau tujuannya adalah untuk mendapatkan enzim sebanyak mungkin tanpa memperhatikan terlalu banyak untuk kemurnian mutlak, maka tingkat pemurnian mungkin akan dikorbankan untuk pemulihan. Di sisi lain, jika fraksionasi adalah langkah pertama dari bahan sumber tersedia, pemulihan bisa dikorbankan untuk kemurnian. Dalam banyak kasus yang lebih canggih proses (kromatografi pertukaran ion kromatografi afinitas adsorpsi) dapat mengikuti fraksionasi amonium sulfat dan perilaku enzim yang diinginkan mungkin sama terlepas dari jumlah pengotor. Dalam kasus yang memotong luas amonium sulfat dapat digunakan, sehingga pemurnian relatif sedikit, langkah yang pada dasarnya membersihkan.
Solusi untuk garam yang akan ditambahkan harus diberikan dengan sistem pengadukan, dan amonium sulfat padat ditimbang keluar. Setiap benjolan harus dipecah sebelum perlahan menambahkan padatan. Bit pertama bisa dilarutkan dalam cukup cepat, tetapi sebagai persen kejenuhan yang dimaksud adalah kenaikan terakhir mendekati garam harus ditambahkan lebih lambat. Udara terlarut yang keluar dari solusi dan menyebabkan buih, namun tidak ada salahnya dilakukan kecuali overvigorous aduk itu sendiri menyebabkan buih, dalam hal pengaruh tegangan permukaan pada protein yang tertangkap dalam gelembung dapat menyebabkan denaturasi. Setelah bit terakhir garam telah dilarutkan, aduk harus terus selama 10 - 30 menit untuk memungkinkan equilibrium lengkap antara protein terlarut dan agregasi, dibandingkan dengan solusi yang disentrifus. Umumnya sekitar 105 g / menit sudah cukup, yaitu 10.000x g selama 10 menit atau 3.000x g selama 30 menit, meskipun pada konsentrasi garam yang lebih tinggi agak lebih sentrifugasi mungkin diperlukan. Supernatan dialirkan, volume mencatat, dan jumlah garam yang dibutuhkan untuk pemotongan berikutnya dihitung. Endapan dilarutkan dalam buffer yang cocok. Perhatikan bahwa volume buffer perlu tidak lebih dari 1 - 2 kali volume endapan, karena itu akan cukup untuk mengurangi konsentrasi garam di bawah titik pengendapan protein ini. Jika semua endapan tidak larut, bahan larut mungkin didenaturasi / partikulat, dan harus dihilangkan dengan sentrifugasi. Itu selalu yang terbaik untuk menjaga solusi sebagai terkonsentrasi di protein mungkin. Hal ini meningkatkan stabilitas, dan selalu casier untuk mencairkan sesuatu yang lebih dari itu adalah untuk reconcentrate itu.
Endapan dipekatkan mengandung sejumlah besar sulfat amonium, dan biasanya ini harus dihapus sebelum melanjutkan ke langkah berikutnya. Dialisis atau filtrasi gel pada kolom "desalting" adalah metode biasa yang digunakan. Pengukuran aktivitas enzim dapat dilakukan pada endapan dipekatkan atau pada supernatan, tapi berhati-hatilah dalam kasus yang terakhir jumlah amonium sulfat ditambahkan ke dalam campuran dengan sampel bisa mengganggu tes tersebut; endapan selalu harus diuji pula, untuk meskipun kerugian dalam fraksinasi amonium sulfat biasanya kecil, aktivitas sembuh dalam endapan mungkin tidak sebanyak perbedaan antara supernatant berturut-turut.
Daripada melarutkan garam yang solid ke dalam sampel, dimungkinkan untuk menambah volume yang cocok larutan jenuh, bukan dalam cara yang sama seperti menambahkan pelarut organik. Hal ini sangat berguna jika enzim ini semua dipicu oleh kejenuhan 50%, karena hal ini hanya akan melibatkan meningkat dua kali lipat volume. Pada skala besar ini akan diterima, tetapi dalam skala kecil dapat menjadi metode yang tepat. Persen lebih tinggi masih lebih membutuhkan peningkatan dalam volume, dan dilusi dari protein mengarah ke kebutuhan kejenuhan persen masih lebih tinggi untuk presipitasi setara, sehingga metode ini tidak disarankan untuk pergi jauh di atas 50%.
Hal penting untuk diingat adalah bahwa garam pernah presipitat semua enzim, tetapi hanya mengurangi kelarutan nya. Jika campuran mulai mengandung enzim Anda, katakanlah, 1 mg mL-1, kemudian pengurangan dalam kelarutan untuk 0,1 mg mL-1 menyebabkan 90% dari itu untuk mengendapkan. Ini akan menjadi pemulihan diterima. Di sisi lain, jika enzim Anda hanya pada 0,1 mg mL-1 untuk memulai dengan, konsentrasi garam yang sama tidak akan menyebabkan pengendapan apapun. Dengan kata lain, konsentrasi garam jangkauan untuk curah bukanlah milik absolut dari enzim yang bersangkutan, namun tergantung pada sifat-sifat protein lain yang hadir (kopresipitasi) dan pada konsentrasi protein dalam larutan awal. Konsentrasi garam yang berbeda mungkin diperlukan pada tahapan yang berbeda dalam prosedur pemurnian.
Akhirnya, aplikasi penting dari prosedur penggaraman AOU tidak begitu banyak untuk sampel fraksionasi, tetapi untuk konsentrasinya. Sebuah cluate dari kolom pertukaran ion atau dari filtrasi gel mungkin perlu berkonsentrasi. Penggaraman keluar dengan menambahkan amonium sulfat yang cukup untuk mengendapkan semua protein adalah cara yang efisien untuk melakukan hal ini asalkan sampel tidak terlalu encer untuk mulai dengan. Hal ini mudah untuk larut dalam amonium sulfat 60 g untuk setiap 100 mL, untuk memberikan sekitar 85% jenuh larutan. Beberapa protein memiliki kelarutan lebih dari 0,1 mg mL-1 pada tingkat amonium sulfat. Tetapi jika konsentrasi protein mulai kurang dari 1 mg mL-1. Salah satu harus mencoba untuk meningkatkan ini dengan, misalnya, ultrafiltrasi sebelum salting out.
